首都医科大学罗大力教授团队在Circulation杂志发表了题为“FunctionalCalsequestrin-1IsExpressedintheHeartandItsDeficiencyIsCausallyRelatedtoMalignantHyperthermia-LikeArrhythmia”的文章，阐明了异氟烷或高热造成的Casq1解聚化可降低其对雷诺定受体2(Ryanodinereceptor-2,RyR2)介导的钙释放的抑制作用，从而引起恶性高热(malignanthyperthermia,MH)和环境中暑(environmentalheatstroke,EHS)样心律失常。
背景：钙螯合蛋白(Casqs)，包括Casq1（骨骼肌型）和Casq2（心肌型）两种亚型，可以分别缓冲Ca2+、调节在骨骼肌和心肌肌浆网（sarcoplasmicreticulum，SR）内钙的释放。Casq1或Casq2突变可导致人类遗传疾病包括MH/EHS和儿茶酚胺能多态性室性心动过速（catecholaminergicpolymorphicventriculartachycardia(CPVT)）。
CPVT的主要诱发原因是心肌SR中编码RyR2(ryanodinereceptor-2)(Ca2+释放通道的组成部分)和Casq2(calsequestrin-2)(Ca2+缓冲蛋白)的基因突变。舒张期过早自发性SRCa2+释放、Na+/Ca2+交换体激活和去极化迟后除极(DADs)的产生是发生CPVT的高风险因素。MH/EHS是一种遗传性亚临床肌肉病，由挥发性麻醉药、去极化肌肉松弛剂、剧烈运动、发热引发，包括心动过速、高碳酸血症、肌肉强直、高热、酸中*和横纹肌溶解等症状。丹曲林，一种RyR拮抗剂，是专门用于治疗MH/EHS的药物。尚未在心脏中检测到Casq1蛋白表达，但Casq1基因在人类心脏和大鼠心室表达的线索已被揭示，Casq1内含子2的变异与白种人的静息心率加快有关。因此，作者假设Casq1也在心脏中表达，且可作为独立致病因素，在其改变时，探究是否可引起MH/EHS样心律失常。
关键词：麻醉药、心律失常、钙螯合蛋白、恶性高热、CPVT、聚合反应
方法：RT-PCR、westernblot、免疫共沉淀、化学交联、电标测：野生型和Casq1-KO小鼠在麻醉后被肝素化并处死。快速切除心脏并安装在Langendorff装置上，通过主动脉逆行灌注Tyrode溶液，其中含有（以mmol/L为单位）NaCl、KCl5.4、MgCl21.2、NaH2PO41.2、D-葡萄糖10、HEPES20和CaCl21.8（pH7.4)，用95%O2-5%CO2气体混合物充氧，温度保持在37C。稳定10分钟后，进行心电图记录。测量心电图后，将64个电极（8×8个网格；6mm×6mm面积；0.20mm电极直径；0.36mm电极间距）与电标测系统（MappingLab，UnitedKingdom)用于记录窦性心律下左心室游离壁的心外膜标测。使用EMapRecord记录标测数据并通过EMapScope软件进行分析。
结果：
1、Casq1亚型在小鼠和人心脏中的表达作者通过westernblot、免疫染色、化学交联等技术，分析了Casq1在大鼠和小鼠心脏、乳鼠心肌细胞（NRVMs）和大鼠胚胎心肌细胞系(H9C2)中的表达来研究Casq1是否在心脏中表达。
图1Casq1在小鼠和人类心脏中的表达研究发现，Casq1mRNA和蛋白在所有组织和细胞裂解液中的表达低于Casq2(图1A和1B)；在小鼠心室和心房的SR中，Casq1以低分子量单体和高分子量样蛋白的形式大量表达，这可能是骨骼肌中Casq1的聚合形式(图1C)；进一步通过试剂交联法分析，Casq1主要以聚合物的形式出现，而Casq2则以其单体、二聚体和三聚体构象存在(图1D)。Casq1蛋白在二尖瓣反流和心肌肥厚患者的心耳和心室中也有表达，心室中Casq1被修饰成更大的分子量(图1E)，Casq1单体在人心耳和小鼠心室中也被发现具有相似的分子量。对小鼠心室和心肌细胞的免疫染色分析表明，在Casq1染色的心室中观察到细胞间隙的非特异性标记，但在分离的心肌细胞中没有观察到标记(图1F)。
2、异氟烷诱导Casq1-CKO和Casq1-KO小鼠MH样心动过速为了确定Casq1在心脏中的功能，作者构建了心脏特异性敲除(Casq1-cko)和全身敲除(Casq1-ko)小鼠模型，并通过心电图与电标测技术检测两种小鼠在异氟烷诱导下是否出现MH样心动过速。
图2Casq1-cko和Casq1-ko小鼠的心电图变化
结果显示，1%异氟烷存在时，Casq1-KO和Casq1-CKO小鼠的基础心率增加，异丙肾上腺素（ISO）刺激交感神经后，小鼠的心率加快(图2A-C)，但无Casq2-KO小鼠中发现的任何CPVT迹象。在Langendorff灌注心脏中，心电图显示窦性心率增加(图2D)和在体结果相似。此外，心外膜电标测在同一Casq1-KO或Casq1-CKO小鼠中显示出异位自发放电和频繁的室性早搏或偶发性室性心动过速(图2E)，提示异常放电和心动过速与躯体神经调节无关。异氟烷用量增加到2%时,在病人和动物模型中均可诱导MH事件,Casq1-KO和Casq1-CKO小鼠表现出丹曲林敏感的室性早搏和单向室性心动过速(图2B和2C)，与Casq2缺陷小鼠和暴露于诱导剂的多型或多态室性心动过速患者的CPVT不同。
3、升高的Ca2+波和过早的Ca2+瞬变是MH样心律失常的原因SR中Ca2+含量和循环的紊乱可能导致细胞电稳态紊乱，从而诱
发DADs和EADs。作者通过共聚焦技术检测了Casq1-CKO小鼠新鲜分离和刺激条件下的心肌细胞内的Ca2+活性。
图3Casq1-cko小鼠新鲜分离的心室肌细胞的胞内Ca2+信号
结果显示，与WT小鼠的心肌细胞相比(图3A)，Casq1-CKO小鼠心肌细胞在基础状态下表现出更高的舒张期Ca2+早期瞬变(PCT)和Ca2+振荡(CO)频率，并且在2%异氟烷下，PCT和CO频率显著增加。在本研究中，局部或全部Ca2+提前释放通常是一个持续的过程，影响Ca2+基线的平稳(图3A1);因此，异氟烷诱导的Ca2+异常信号被分为两种类型:即PCT和CO。在Casq1-CKO肌细胞中，单个细胞Ca2+瞬态间歇期间的PCT发生率要高得多(图3A3)。与对照组相比，Ca2+瞬变的基线和振幅没有改变，无论异氟烷是否存在，达到50%峰值的时间均显著减少(图3B)。Casq1-CKO肌细胞和异氟烷触发的Ca2+火花和钙波(遍及整个细胞)的增加，在异氟烷存在时尤为显著(图3C)。研究发现，在基线和异氟烷处理的Casq1-CKO心肌细胞中，SRCa2+泄漏与对照组相比没有差异，对照组和Casq1-CKO肌细胞Ca2+泄漏指数增加与SRCa2+含量增加的关系无明显差异(图3D)。
4、Casq1-KO小鼠中RyR活性的上调与室性心律失常有关既往研究表明，Casq1和RyR1通过支架蛋白triadin和junctin相互作用，跨越SR膜，并通过其腔域结合到骨骼肌中的Casq1和RyR1。为了研究Casq1与心脏SR蛋白的关联，作者用免疫印迹实验进行了验证，为了进一步研究Casq1/RyR2在心脏中的关系，作者使用Casq1-siRNA分析Casq1表达改变与功能异常之间的关系，使用过度表达Casq1(Casq1-wt)或编码Casq1Ca2+结合域的剪切Casq1基因(c-末端9个氨基酸[Casq1-Δ9])，腺病*转染培养的NRVMCasq1mRNA和蛋白表达，检测其相关关系。
图4Casq1与RyR2、junctin或triadin在小鼠心室中的相互作用。
结果显示，Casq1-CKO小鼠中Casq1单体/二聚体与RyR2的相互作用显著减少，但与WT相比，聚合物与RyR2的相互作用和共定位在心室中保持不变(图4B和4C)。
图5通过控制Casq1表达，NRVM中SR相关蛋白的表达变化
结果显示，在Casq1敲低的细胞中，Junctin的表达减少(图5A和5B)。与Casq1-wt细胞相比，Casq1-Δ9细胞中发现了大量的Casq1单体，但较少的聚合物(图5C)。Casq1-wt细胞中RyR2的表达下降，而Casq1-Δ9细胞中则没有。Casq1-Δ9细胞中triadin和junctin的表达减少，这可能是由于剪切干扰了其与triadin/junctin的相互作用导致(图5D)。
图6控制Casq1表达的NRVM细胞内Ca2+信号转导改变
功能评估显示，在Casq1敲除细胞中，2%的异氟烷存在下，窦性自发Ca2+瞬变增加，Ca2+振荡增加，并且SR中咖啡因诱导的Ca2+释放含量和达到50%峰值的时间降低(图6A)。相反，Casq1-wt转染的细胞，与载体转染的细胞相比，Ca2+瞬时速率和振幅降低，SR中Ca2+含量更高(图6B)。在Casq1敲除的细胞中，2%的异氟烷也会增加Ca2+火花(图6C)，而Casq1过表达的细胞中窦性钙火花会减少，Casq1-Δ9转染的细胞中则没有减少(图6D)。
5、异氟醚或环境热引起的Casq1解聚可导致MH/EHS样心律失常最后，作者调查了为什么MH/EHS样心律失常是由特定的诱因如异氟烷和高热引起的。由于Casq1的构象对其功能的实现非常重要，作者采用了交联法检测WT心室中Casq1的构象是否在2%异氟醚下发生改变。
图7异氟烷或热诱导Casq1解聚
图8大鼠心室肌和骨骼肌Casq1热解聚
结果显示，正常心室在异氟烷处理，而未使用ISO治疗的情况下，Casq1以单体形式存在较多，聚合物形式较少，并显示出高分子量(在kDa)RyR2复合体减少，而Casq2保持不变的构象（图7A）。异氟烷存在时，Casq1-CKO心室发生更多的解聚反应(图7B)。通过交联法和Westernblot分析发现，异氟烷存在下，Casq1和Casq1/RyR2复合物(kDa)显著下降(图7C)，表明Casq1与RyR2的结合被破坏。41℃加热时，WT心室中也发现了较强的Casq1寡聚甚至变性(图7D)，这是易感患者EHS的诱导剂。为了避免组织对热的反应，作者直接处理大鼠心室和腓肠肌的SR裂解液，41℃加热，观察到大鼠两种类型的肌肉中Casq1显著的寡聚(图8A)，就像在小鼠中观察到的一样(图7D)。综上所述，Casq1的构象变化对挥发性麻醉剂和高温敏感。
结论：
本文首次证明了Casq1在心脏中表达且可缓冲肌浆网Ca2+和调节基础心率。Casq1缺乏可导致窦性心动过速、舒张期自发性钙释放增加和可诱导的室性心动过速。异氟烷和高热是MH/EHS的特异性诱因，可引起Casq1寡聚化，降低其对RyR的调节作用，从而在MH/EHS患者中引起室性心动过速。
解析文献：[1]Sun,Z.,Wang,L.,Han,L.,Wang,Y.,Luo,D..Functionalcalsequestrin-1isexpressedintheheartanditsdeficiencyiscausallyrelatedtomalignanthyperthermia-likearrhythmia.Circulation,(10),-.
相关产品
多通道电生理标测系统电标测系统可用于整体心脏
电标测系统可用于整体心脏、心脏部分组织、细胞等电信号标测，可监测参数包括：动作电位活动频率、动作电位起搏点位置、传导方向、传导速度、传导离散度、复极离散度、QT间期离散度等。